mRNA甲基化有5种主要的形式，分别是m7G、m6A、m6Am、Cap1和Cap2，其中Cap1和Cap2存在于mRNA的帽子结构上，Cap1是转录的第一个核苷酸上存在2’-O-甲基化，而Cap2是转录的第一个和第二个核苷酸上都存在2’-O-甲基化。虽然Cap2已经被发现了近50年了，但是由于缺乏有效的检测手段，到目前为止，Cap2的功能仍不清楚。2023年2月1日，来自美国康奈尔大学的Samie R. Jaffrey研究团队在Nature上发表题为mRNA ageing shapes the Cap2 methylome in mammalian mRNA的文章，他们开发了一种名为CLAM-Cap-seq的技术在转录组水平分析并定量Cap2，发现Cap2可以存在于所有mRNA上，在细胞质中mRNA随着“衰老”缓慢地由Cap1转变为Cap2，在半衰期较长的mRNA上Cap2明显富集，Cap1水平上升可以激活RIG-I介导的免疫反应，但是Cap1到Cap2的转变会显著降低RNA结合并激活RIG-I的能力，细胞中Cap1向Cap2缓慢转化的过程可能可以使得机体更好地应对病毒。为了研究细胞中Cap2的水平及其动态变化，研究人员开发了一种名为CapTag-seq的测序技术，来检测细胞中具有Cap2修饰的mRNA水平，发现在不同的哺乳动物细胞系中Cap2的相对丰度差异较大，例如在小鼠胚胎干细胞中大约是25%，在HEK293T细胞中是40%，在A549和MCF-7细胞中高达54%和56%，此外，秀丽线虫中Cap2只有0.9%，果蝇和斑马鱼中水平也非常低，大约只有12%。在小鼠的不同组织中，Cap2水平差异也很大，大脑中大约有8%，而脾脏中大约有30%。此外，Cap2修饰存在于所有16种二核苷酸组合中，虽然程度存在差异。为了研究是哪些mRNA上存在Cap2修饰，他们开发了CLAM-Cap-seq技术，将带有帽子标签的mRNA与其产生的cDNA偶联在一起，通过测序就可以知道转录组中每个mRNA帽子的甲基化状态，此外，他们还开发了一种生化技术，CapOligo-PAGE，来验证CLAM-Cap-seq的真实性。通过CLAM-Cap-seq，他们得到了细胞的Cap2甲基化组，通过聚类分析，发现Cap2修饰的mRNA与特定的细胞通路相关，包括基本代谢通路以及看家基因。由于Cap2是在细胞质中形成的，他们猜测Cap2可能会与细胞质中mRNA的翻译以及稳定性相关，利用polysome-TSS-seq，他们发现Cap2轻微富集于翻译效率增加的mRNA上，并且还发现最高和最低水平Cap2的mRNA的半衰期寿命存在很大差异。但是进一步研究发现，Cap2修饰并不会赋予mRNA更高的稳定性，而是更长的半衰期造成了更高的Cap2水平，他们发现”年轻“的mRNA大约具有11%的Cap2修饰水平，而”老“的mRNA大约具有42%的Cap2修饰水平，也就是说，随着mRNA的”衰老“，Cap2水平逐渐上升。最后，为了研究Cap2甲基化修饰的功能，他们敲除了负责给mRNA加上Cap2修饰的甲基转移酶CMTR2，通过转录组测序发现，下调的基因主要富集在翻译和RNA加工途径上，而上调的基因主要与先天免疫反应和炎症通路相关，CMTR2敲除会显著诱导抗病毒基因干扰素刺激基因（ISGs）的表达。RNA的甲基化修饰会影响其与免疫感受器RIG-I的结合，他们发现RIG-I介导了CMTR2敲除细胞中ISGs的表达上调，敲除RIG-I可以显著抑制CMTR2敲除细胞中ISGs的上调，并且，RIG-I可以与Cap0或Cap1 RNA结合，但是与Cap2结合的RIG-I显著减少，此外，在水平很高的情况下，Cap1 RNA可以激活RIG-I，但是Cap2可以抑制Cap1与RIG-I结合，从而抑制Cap1诱导的免疫反应，因此，Cap2修饰会抑制RIG-I的激活。但是细胞中为什么会存在一个缓慢的Cap1到Cap2的转换过程呢？他们认为这可能是机体为了对抗病毒，病毒基因组上自身就编码可以将RNA Cap1化的酶，但是病毒并不具有CMTR2，因此病毒必须要利用宿主的CMTR2来完成Cap2修饰，他们发现病毒诱导的Cap1水平上升可以激活先天免疫反应，而在CMTR2过表达细胞中，病毒诱导的免疫反应被抑制，说明细胞维持缓慢的Cap2甲基化过程可能是为了检测并响应病毒的入侵，在病毒的Cap1 RNA获得足够高水平的Cap2之前激活免疫反应。总的来说，这项研究为RNA的Cap2修饰研究提供了一套有效的方法，发现在细胞质中随着mRNA的衰老，Cap1逐渐向Cap2转化，Cap2富集于半衰期更长的mRNA上，并且Cap1水平上升会激活免疫反应，而Cap2可以抑制Cap1诱导的免疫反应。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05668-z
